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ELISA实验原理与操作详解-武汉赛拓森生物

发布时间：2026-01-16 17:48:43

一、ELISA 是什么？

酶联免疫吸附测定 是一种基于抗原-抗体特异性结合和酶标放大系统的高灵敏度、高特异性的生物化学检测技术。简单来说，它利用抗体捕获目标分子（抗原），然后通过酶促反应产生颜色信号，信号的强弱与样品中目标分子的含量成正比。

核心要素：

1.抗原： 被检测的物质（如蛋白、激素、病毒、抗体等）。

2.抗体： 特异性识别和结合抗原。

3.酶标物： 与抗体或抗原连接的酶（常用HRP或AP）。

4.底物： 酶作用的物质，反应后产生可检测信号（颜色、荧光、化学发光）。

二、主要类型及原理（最核心的部分）

根据实验设计和检测目标的不同，主要分为四类：

1. 直接ELISA

· 原理： 将待测抗原直接吸附在固相载体（酶标板）上，然后直接用酶标一抗与之结合，加入底物显色。

· 步骤： 包被抗原 → 封闭 → 加酶标一抗 → 洗涤 → 加底物 → 检测。

· 优点： 操作简单，步骤少，时间短，交叉反应风险低。

· 缺点： 每个待测抗原都需要特异的酶标抗体，灵活性差；信号放大作用弱，灵敏度较低。

· 应用： 适用于检测已知的高浓度抗原。

2. 间接ELISA

· 原理： 将抗原包被在板上，先加非酶标一抗与抗原结合，再加酶标二抗（针对一抗的种属）与一抗结合。

· 步骤： 包被抗原 → 封闭 → 加一抗 → 洗涤 → 加酶标二抗 → 洗涤 → 加底物 → 检测。

优点：

· 信号放大： 一个一抗可以结合多个二抗，灵敏度高于直接法。

· 灵活性高： 只需一种酶标二抗即可检测同一种属来源的所有一抗，成本低。

· 缺点： 多一步孵育和洗涤，步骤较多；可能出现非特异性交叉反应（二抗与抗原或板子结合）。

· 应用： 最常用，特别适用于检测抗体，如血清学检测（HIV抗体、自身免疫病抗体等）。

3. 夹心ELISA

· 原理： 使用两种特异性抗体分别识别抗原的不同表位。先包被捕获抗体，捕获样品中的抗原，再加入检测抗体（酶标）形成“抗体-抗原-抗体”复合物。

· 步骤： 包被捕获抗体 → 封闭 → 加样品（含抗原） → 洗涤 → 加检测抗体（酶标） → 洗涤 → 加底物 → 检测。

优点：

· 灵敏度最高： 双重特异性，背景低。

· 特异性强： 适用于复杂样品（如血清、细胞裂解液）中低浓度抗原的检测。

· 缺点： 需要配对好的两种抗体（识别不同表位且不互相干扰），开发成本高。

· 应用： 检测抗原的黄金标准，如细胞因子（IL-6， TNF-α）、肿瘤标志物（CEA， AFP）的检测。

4. 竞争ELISA

· 原理： 用于检测小分子抗原（半抗原）。样品中的游离抗原与固定量的酶标抗原竞争结合有限量的抗体。

两种模式：

· 抗体包被法： 样品抗原和酶标抗原竞争结合包被在板上的抗体。

· 抗原包被法： 样品抗原和板上的包被抗原竞争结合溶液中的酶标抗体。

· 结果判读： 信号强度与样品中抗原浓度成反比。样品抗原越多，酶标抗原结合的越少，颜色越浅。

· 应用： 检测小分子物质，如激素、药物、毒素（黄曲霉素）等。

三、标准实验步骤（以间接ELISA和夹心ELISA为例）

 通用流程：包被 → 封闭 → 孵育一抗/抗原 → 孵育二抗/检测抗体 → 显色 → 终止 → 读数

1.包被：

 用碳酸盐包被缓冲液稀释抗原或捕获抗体，加入酶标板孔中（通常100μL/孔）。

4℃孵育过夜或37℃孵育1-2小时，使蛋白物理吸附于板壁。

2.洗涤：

弃去孔内液体，用PBST（含0.05% Tween-20的PBS）注满各孔，静置约1分钟，然后弃去。

重复3次。此步骤旨在去除未结合的分子，减少背景。所有后续孵育步骤后均需洗涤。

3.封闭：

加入封闭液（常用含1-5% BSA或脱脂奶粉的PBST），200-300μL/孔。

37℃孵育1-2小时或4℃过夜。目的是覆盖板上未被占据的位点，防止后续抗体非特异性吸附。

4.孵育一抗/样品（抗原）：

（间接法）加入用封闭液稀释的一抗。

（夹心法）加入用稀释液稀释的待测样品或标准品。

37℃孵育1-2小时。

5.孵育二抗/检测抗体：

（间接法）加入针对一抗种属的酶标二抗。

（夹心法）加入酶标的检测抗体。

37℃避光孵育1小时。

6.显色：

配制酶促底物溶液（如TMB），加入各孔，避光反应。

关键： 反应时间需一致（通常10-30分钟），观察到标准品孔出现明显颜色梯度时即可终止。

7.终止：

加入终止液（如2M H₂SO₄用于TMB），颜色由蓝变黄。

此步骤停止酶反应，固定信号。

8.读数：

立即使用酶标仪在特定波长下测量吸光度（OD值）。

TMB：检测波长450nm，校正波长630或650nm。

四、数据分析

1.绘制标准曲线：

 使用标准品（已知浓度）的OD值，以浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），用四参数逻辑（4-PL）曲线或双对数曲线进行拟合。R² > 0.99 表示曲线良好。

2.计算样品浓度：

将样品孔的OD值代入标准曲线方程，即可计算出浓度。对于超出标准曲线范围的样品，需适当稀释后重测。

3.报告单位： 常用 pg/mL， ng/mL 等。

五、关键注意事项与常见问题

·样本： 血清/血浆需适当稀释，避免基质效应。细胞上清需离心去除杂质。

·抗体： 选择合适的抗体对（夹心法），优化工作浓度（做预实验棋盘滴定）。

·对照设置： 必须设置！

 空白孔： 仅加底物和终止液，校正仪器零点。

 阴性对照： 不含目标物的样品，确定背景值。

 阳性对照： 已知阳性的样品，确认实验有效。

 标准品： 用于绘制曲线。

·重复： 建议每个样本和标准品做复孔或三孔，取平均值，保证重复性。

·洗涤： 洗涤不彻底是高背景的主要原因，洗涤过度则可能导致信号降低。

·孵育： 确保温度和时间一致，避免边缘效应（孔间温度不均），可用封板膜。

常见问题排查：

·信号弱/无信号： 抗体失效、浓度过低；酶失活；底物失效；孵育时间太短

·背景过高： 封闭不充分；洗涤不彻底；抗体浓度过高或非特异性结合；底物被污染或曝光。

·重复性差： 加样不准；洗涤不均；孵育温度/时间不一致；孔间交叉污染。

六、ELISA的优势与局限

优势：

·高灵敏度和特异性

·高通量，可同时处理大量样品

·定量准确，操作相对简单

·试剂稳定，成本相对较低

局限：

·只能检测已知抗原/抗体（需有特异性试剂）

·对抗原-抗体结合亲和力依赖性强

·对于某些复杂样品（如细胞裂解液）可能存在干扰

· 是终点检测，无法实时监测

总结

ELISA是生命科学研究和临床诊断中不可或缺的基石技术。成功进行ELISA实验的关键在于： 

1.根据检测目标选择合适的类型（检测抗体用间接法，检测抗原用夹心法）。

2.优化每一步的条件（包被浓度、封闭液、抗体稀释度等）。

3.严格进行对照设置和标准化操作。

4.准确地进行数据分析和结果解读。

5.希望这份超详细的指南能帮助你全面理解并成功完成ELISA实验！