ELISA实验成功关键：全面注意事项指南，助你成功实验！

发布时间：2026-01-16 18:02:03

ELISA实验成功关键：全面注意事项指南

ELISA实验步骤看似简单，但“细节决定成败”。任何一步的疏忽都可能导致结果出现假阳性、假阴性、高背景或重复性差等问题。本指南将从实验前、中、后三个阶段，系统阐述核心注意事项。

一、 实验前准备与设计阶段

明确目标与选择合适的类型

· 明确检测物：是检测抗原还是抗体？是大分子蛋白还是小分子半抗原？

· 选择正确类型：

o 检测未知样本中的抗体（如血清抗体）→ 间接ELISA。

o 检测复杂样本中的蛋白质抗原 → 夹心ELISA（需配对抗体）。

o 检测小分子（如药物、激素）→ 竞争ELISA。

· 了解样本基质：血清、血浆、细胞上清、组织裂解液的成分不同，可能含有干扰物质（如嗜异性抗体、补体、蛋白酶）。

试剂与材料准备

· 试剂盒选择：对于常规检测，优先使用经过验证的商业化试剂盒，并严格遵循其说明书。自建方法需大量优化。

· 抗体配对（夹心法关键）：捕获抗体与检测抗体必须识别抗原的不同表位，且亲和力匹配。避免使用同一物种来源的配对抗体，以防二抗交叉结合。

· 样本处理：

o 充分混匀：避免分装不均匀，尤其是粘稠样本。

o 离心：血清/血浆样本建议离心去除杂质或纤维蛋白。

o 分装保存：避免反复冻融，建议一次性分装后于-20℃或-80℃保存。

o 稀释：使用试剂盒指定的或经过优化的稀释液。高背景时，可增加稀释度或使用专用稀释液（含正常血清或阻断剂）。

o 板子选择：使用高质量、蛋白结合力一致的高结合力酶标板。不同品牌板子可能有差异，建议固定品牌。

二、 实验操作过程阶段

包被

· 包被缓冲液：通常使用碳酸盐缓冲液（pH 9.6），其碱性环境有利于蛋白质吸附。确保pH准确。

· 包被浓度与体积：需通过预实验确定最佳包被浓度。确保孔内液面平整，避免孔壁边缘干燥，通常使用100μL/孔。

· 孵育：4℃过夜包被通常比37℃ 1-2小时更均匀、结合更好。

封闭（至关重要！）

· 目的：封闭未被抗原占据的位点，减少非特异性吸附。

· 封闭液选择：常用1-5% BSA、脱脂奶粉、酪蛋白或商品化专用封闭液。注意：脱脂奶粉可能含有碱性磷酸酶（AP），不适用于AP系统；某些情况下可能干扰特定抗原-抗体反应。

· 时间与温度：室温1-2小时或4℃过夜。确保封闭充分。

洗涤（最易出问题的环节！）

· 原则：充分、彻底。残留的未结合物质是背景升高和重复性差的主要原因。

· 方法：

o 使用多通道移液器或自动洗板机。

o 每孔至少加满300μL洗涤液（通常为PBST）。

o 浸泡：加入洗涤液后，静置30秒至1分钟，有助于解离弱结合物质。

o 弃液：快速、用力地在吸水纸上拍干，但避免孔与孔之间的交叉污染。

o 次数：通常洗涤3-5次。夹心法或高背景时，可增加至5-6次。

孵育（一抗/二抗/样本）

· 孵育条件：按照说明书建议的温度和时间（通常37℃ 1小时）。所有孵育步骤均需覆盖封板膜，防止蒸发和污染。

· 加样顺序：为保持反应时间一致，应使用多通道移液器按“行”或“列”快速依次加入。避免长时间间隔。

· 设置对照：必须设置！这是结果判读的基石。

o 空白孔：只有底物和终止液（校正仪器零点）。

o 阴性对照：不含目标物的样本（如空白培养基、阴性血清）。

o 阳性对照：已知含有目标物的对照。

o 标准品孔：用于绘制标准曲线。

o （夹心法）仅二抗对照：检查二抗的非特异性结合。

显色与终止

· 底物准备：TMB等底物对光敏感，需避光保存，临用前从4℃取出恢复至室温。

· 显色时间：密切观察阳性对照和标准品最高浓度孔的显色情况。通常在显色适中（蓝色）时终止，避免过度显色（可能导致信号饱和或非特异性背景升高）。

· 终止：加入终止液（如1M H₂SO₄）后，颜色应立即由蓝变黄。加终止液的顺序应与加底物顺序一致。

· 读数时间：终止后，颜色在一段时间内稳定，但仍建议在30分钟内完成读数。

三、 实验后数据分析与问题排查

数据读取

· 酶标仪设置：确保波长设置正确（如TMB主波长450nm）。

· 先读空白孔：用空白孔进行调零。

标准曲线与计算

· 选择合适的拟合模型：通常使用四参数逻辑曲线拟合，尤其适用于宽动态范围的检测。线性范围好的也可用二次方程或直线拟合。

· 检查曲线质量：R²值应 > 0.99。标准点的OD值应在其线性范围内。

· 样本浓度：所有样本的OD值应落在标准曲线的范围内。过高需稀释后重测，过低则说明浓度低于检测限。

常见问题与解决思路

· 高背景/阴性对照值高：封闭不充分、洗涤不彻底、抗体浓度过高、二抗非特异性结合、底物污染或孵育时间/温度过长。

· 信号弱/灵敏度低：试剂失效（特别是酶和底物）、抗体失活或浓度过低、孵育时间/温度不足、样本中目标物含量低或存在基质干扰、显色时间太短。

· 重复性差（孔间差异大）：加样操作不精准、洗涤不一致、微孔板边缘效应（孵育时置于平板中央，避免温度不均）、试剂未充分混匀、孔底有气泡（加样后轻弹板侧去除）。

· 标准曲线不佳：标准品降解或稀释错误、加样误差、移液器不准、拟合模型选择不当。

四、 总则

· 保持一致性：同一批实验使用同一批次的试剂、耗材和仪器。

· 做好记录：详细记录试剂批号、样本处理方式、孵育时间、任何异常情况等。

· 定期校准：对移液器、酶标仪进行定期校准和维护。

· 安全第一：处理临床样本或终止液（强酸）时，遵守生物安全与实验室安全规范。

遵循这份详细的注意事项清单，将极大提高您ELISA实验的成功率，确保获得可信赖的科学数据。